目前NGS法应用广泛，但使用NGS检测扩增时必须要考虑几个技术层面的问题，首先，检测结果精确度很大程度受制于样本的纯度和质量，因为在分析过程中良恶性细胞经常混合在一起。其次因为NGS以读取深度作为评估目的基因拷贝数的关键指标，若要兼具敏感度和特异性，则必须要同时满足深度和覆盖度的要求。最后，目前尚缺乏能证实FISH法和NGS法一致性的对比研究，NGS有时会出现难以解释的结果，因为FISH目前为止被认为是相对更可靠的技术。
3、其他检测方法：NGS也能检测血浆等含有循环DNA的样本，这和NGS检测肿瘤组织的原理类似。循环DNA的获取途径通常对身体具有更小的创伤，并有可能在一定程度上避免肿瘤细胞异质性对检测精确度带来的不利影响。然而血浆为样本检测对NGS检测平台的敏感度和分辨率具有更高的要求，对DNA的丰度也有一定要求，循环DNA检测导致假阴性的可能性较组织检测会更高。此外qRT-PCR也是一种检测MET扩增的方法，但是和FISH法和NGS方法相比PCR法优势不明显，此外PCR法用于界定MET扩增的阈值也没有明确的标准。
二、临床分子病理学特征
1、原发MET扩增：
在多种实体瘤中都发现有原发MET扩增，根据肿瘤基因组计划（TCGA）和cBioPortal数据库提供的数据，MET扩增比较典型的有非小细胞肺癌(NSCLC) ，检出率约＜1-5%；胃癌中约＜1-10%；大约2-4%的结肠癌（CRCs），13%左右的I型肾乳头状癌(PRCCs)和3%左右的II型肾乳头状癌也检出MET扩增，在食管癌和肝细胞癌中检出比例较低。在NSCLC中没有发现吸烟和MET扩增之间具有相关性。在许多恶性肿瘤中MET扩增意味着预后不良。研究发现NSCLC细胞MET扩增度越高，肿瘤的MET驱动依赖性越强。MET高度扩增 (MET /CEP7 ≥5，FISH法)的 NSCLC患者，很少合并其他致癌基因的驱动改变（比如EGFR突变或者ALK融合），而在MET低度扩增（MET / CEP7 ≥1.8 , ≤2.2，FISH法）和中度扩增 （MET / CEP7>2.2 ，<5，FISH法）的患者中，更多合并有其他驱动基因改变（MET高，中，低度扩增合并其他驱动基因改变比例分别为0%，52%，50%）。
2、获得性（继发）MET扩增：
MET扩增可以是原发的也可以是被其他原癌驱动基因（EGFR）次级激活，这也是EGFR等TKI耐药机制之一。根据不同的检测方法和平台提供的数据，在接受一到三代EGFR TKI靶向治疗后的NSCLC患者中大约5%~20%的比例会出现MET扩增。EGFR突变的肿瘤细胞可以绕开EGFR TKI（吉非替尼或者厄洛替尼等）作用的PI3K通路，激活MET这一旁路信号通路，而PI3K通路也可以通过MET介导的HER3信号通路进一步激活。MET扩增也被发现是ALK融合阳性NSCLC癌患者对ALK抑制剂耐药的机制之一。此外，在接受抗EGFR单克隆抗体治疗的结肠癌患者和接受EGFR和BRAF抑制剂联合治疗的BRAF V600E突变的结肠癌患者中也可检测到MET扩增。当患者接受EGFR TKI治疗后MET扩增的次级激活即可发生，这种激活也可以发生在肿瘤细胞的的亚克隆群中。当使用NGS检测的样本混合有MET扩增和非MET扩增的肿瘤细胞时该结果可能会低估MET的扩增程度，为了进一步提高准确度，建议可以联合FISH或者单细胞测序进行补充。
图1：MET扩增的检测示意图
三、靶向治疗
MET扩增水平和MET抑制剂疗效呈正相关。
1、原发性MET扩增
PROFILE 1001研究是最早开展的关于MET抑制剂疗效和MET扩增程度相关性的研究。患者分别分为低度扩增组（MET / CEP7 ≥1.8 , ≤2.2），中度扩增组 （MET / CEP7>2.2 ，<5）和MET高度扩增组 (MET /CEP7 ≥5)，结果提示高度扩增组的客观反应率(ORR)可达67%，低扩增组和中扩增组的客观反应率ORR分别为0%和17%。随后研究组将中度扩增组界定值调整为MET /CEP7值为2.2-4.0，高扩增组界定为MET /CEP7 ≥4.0，最终结果提示总体临床获益最显著的也是高度扩增组，其ORR为40%，中位无进展生存期(PFS)为6.7个月，而低度扩增组和中度扩增组的ORR分别为33%和14%，PFS分别为1.8个月和1.9个月（图2）。
图2：不同MET扩增度患者靶向治疗的疗效
除了MET / CEP7 作为分类参照指数，也有研究揭示MET抑制剂对肺癌的疗效与MET的基因拷贝数（GCN）相关。该研究将卡马替尼用于治疗不同GCN的患者，患者的MET GCN分别为低中高三组，界定值分别为GCN <4, GCN >4 且 <6 和 GCN ≥6 ，结果提示高拷贝数组的ORR最高，可达47%，低拷贝数组合中拷贝数组的ORR分别为0%和17%。另外一种MET抑制剂沃利替尼在PRCCs中的疗效与显示出MET扩增程度相关，与之前的两个研究使用FISH 法检测MET扩增不同，本研究使用的是NGS法，MET的扩增定义为MET的 GCN≥ 6。MET扩增的PRCC患者ORR 可达43%，而GCN＜6（本研究将其定义为未无MET扩增）的患者ORR为0%。
最后来自一项名为AcSé关于克唑替尼的研究数据表明，高度MET扩增(MET / CEP7比值≥5)或中度水平(MET /CEP7比值>2.2 , <5)组的患者有着较高的药物反应率，而低MET扩增组(MET /CEP7比值≥1.8 ，≤2.2)或染色体重复/多倍体组(MET GCN >6或者MET / CEP7比值<1.8)的药物反应率较低，该研究还证实使用MET /CEP7的方法较测量GCN法能更好地评估MET扩增情况。
2、获得性耐药
对于依赖于另一驱动基因且出现MET次级激活的肿瘤患者，针对原发驱动基因和MET信号通路的联合治疗可能有效。例如EGFR突变的患者在使用EGFR TKI后耐药进展，如果是MET扩增导致的耐药，那么联合使用EGFR TKI和MET抑制剂可能是行之有效的方案。研究揭示对于EGFR突变伴随MET扩增耐药（FISH或者NGS检测结果为MET /CEP7≥2或者GCN≥5）的患者使用奥西替尼和沃利替尼联合治疗的ORR可达30%。另一项研究提示接受一/二代EGFR TKI治疗的患者出现MET扩增耐药，接受吉非替尼和特泊替尼（默克公司于2020年3月在日本批准上市，被视为革命性的MET抑制剂类药物）联合治疗，其ORR可高达67%。其他药物比如EGFR和 MET双特异性抗体JNJ-372，在EGFR耐药进展的患者中也表现出了良好的活性，这些药物在继发MET扩增的恶性肿瘤中的疗效会有更多研究揭晓。
有趣的是，联合治疗的疗效也和MET的GCN相关，一项 Ib/II期 临床研究将EGFR突变合并MET扩增的患者根据CGN分为三组（GCN <4, GCN >4 且 <6 and GCN ≥6），其中 GCN ≥6的高拷贝数组的ORR可达47%，中、低拷贝数组ORR分别为22%和12%。
MET突变
一、MET突变类型
MET的突变可发生在MET基因组内不同的位置，包括激酶结构域、14号外显子侧面的内含子剪接位点和细胞外结构域。
1、激酶结构域突变：MET突变首次于1997年在一个遗传性肾乳头状癌（PRCCs）患者体内被发现。这种胚系（生殖系）突变位点包括V1092I、H1094R/Y、M1131T、V1188L、V1220I、M1250T和D1228H/N/V。MET激酶结构域突变导致MET酪氨酸激酶活性异常增强，体外实验证实小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3细胞系）中转染MET过表达能导致细胞表型改变和恶性细胞形成，动物实验也证实能诱导恶性肿瘤的形成。非家族性PRCCs中约15%的患者可发现有体系MET突变，其中I型肾乳头状癌中多见（17%），II型肾乳头状癌中相对较少（2%）。PRCCs的体系MET突变包括了 V1092I、H1094L/R/Y、N1100Y、H1106D、M1131T、V1188L、L1195V、V1220I、D1228H/N/V、Y1230A/C/D/H、Y1235D 和M1250I/等位点，这和胚系MET突变有部分重叠。其中一些突变的活性相对较低，需要同时伴随MET扩增才能驱动恶性肿瘤的发生。MET激酶结构域的突变也可在其他肿瘤中发现，包括肝细胞癌和头颈部肿瘤，头颈部肿瘤中METY1235D突变的比例最高可达14%。
除了原发性突变，MET结构域突变也可以是继发性获得，这也是MET TKI的耐药机制之一。对于非小细胞肺癌，MET EX14、METY1230C、METY1230H、METD1228H 和 METD1228这几种突变可通过干扰激酶和药物的结合从而介导 肿瘤对克唑替尼的耐药。对于使用NSCLC患者在联合EGFR/MET TKI治疗后若再次出现耐药，MET激酶结构域突变可能是其耐药机制之一。
2、MET14 EX14 突变：正常细胞MET信号通路激活后，E3泛素连接酶CBL结合到MET EX14编码的Y1003（ CbL的酪氨酸结合位点)的近膜域残基，进而导致MET受体的泛素化和降解并形成一个自动调节的负反馈回路。当MET EX14发生突变，导致Y1003的近膜域残基异常，CBL无法与之结合启动受体的泛素化降解程序，导致MET信号通路的持续激活。这些突变中最常见的是碱基置换或者碱基插入/缺失，两种突变的比例在患者身上大约各占一半。
大多数MET EX14的突变发生的机制来源于其RNA的剪接过程受到异常干扰。在野生型状态下，MET前体mRNAs的内含子区域在转录本被翻译成蛋白质之前被剪接移除。突变如果发生在MET EX14侧就会破坏剪接过程，导致MET EX14跳跃移位。这些剪切位点的突变形式大多为范围大小不一的碱基插入/缺失，此外，导致D1010替换的错义突变，如D1010H/N/Y，也能破坏剪接过程。其他例如导致Y1003置换的突变(如Y1003F/N/S)能够干扰Cbl 的结合，与MET14 EX14 RNA剪接位点突变相似，Y1003置换突变也能导致良性细胞的表型改变，促进肿瘤细胞增殖。此外MET EX14的缺失也会导致携带Y1003的近膜结构域的丢失进而诱发类似的机制促进肿瘤发生。
MET EX14突变最开始在小细胞肺癌中被发现，但其实这种突变在NSCLC中更为常见，大约比例为3%~4%。这种突变出现在肺肉瘤样癌中的频率更高，约为9%~22%。MET EX14突变在其他诸如胃癌，神经母细胞瘤等癌种中较为少见。在许多恶性肿瘤中MET EX14突变同样可以是一种继发改变，诸如在EGFR突变的非小细胞肺癌中可能作为EGFR继发耐药的一种机制。在NSCLC患者中，MET EX14跳跃突变（跳读）的患者有吸烟史的比例较高，而出现ALK、ROS1 、RET 融合的患者中吸烟比例较小。
3、其他形式的突变：MET蛋白的信号素结构域与HGF (MET的配体)相互作用，参与形成二聚体导致受体激活。该结构域的突变包括E34K、H150Y、E168D、L269V、L299F、S323G、M362T、N375S和C385Y115,128 131(图3)。N375S是这些突变中最常见的，在NSCLC患者中约有3%~14%的比例。信号素域突变(特别是N375S)是否能激活MET目前尚有争论。有研究显示一些信号素结构域突变能降低MET的HGF结合亲和力，且在未患癌症的个体中也有发现有信息素结构域突变，但不少研究证实N375S能通过激活下游SRC和/或ERK1/2信号通路参与肿瘤形成。
图3：MET不同突变类型示意图
二、MET突变的检测
相比之下，杂交捕获法能很好的规避扩增法暴露的这个问题，杂交捕获法先打断DNA，用长链诱饵寡核苷酸捕获，然后再进行扩增。
三、靶向治疗
1、激酶结构域突变的靶向治疗：针对MET的靶向治疗对于某些MET激酶结构域突变是效的。然而，不同的MET抑制剂对于不同的突变类型效果有所差异。比如II型MET抑制剂卡博替尼和foretinib，对几种激酶结构域突变表现出细胞活性(如D1228N、M1250T和H1094Y/L145)，而I型MET抑制剂克唑替尼等，对上述突变无能为力。MET激酶结构域突变是MET扩增和MET EX14突变的患者对克唑替尼的耐药机制之一。这些突变能将MET激酶从激活的构象转变为非激活状态，而以克唑替尼为代表的I型MET抑制剂是和激活构象的酪氨酸激酶受体结合。
原始性MET激酶结构域突变数据很多来自于PRCC患者。有研究发现对于携带原始胚系MET突变的遗传性PRCC患者给予foretinib治疗，ORR可达50%。而对于获得性MET激酶结构域突变的数据仅仅来自于先前使用MET抑制剂出现耐药的NSCLC患者。激酶结构域突变也被认为是EGFR TKI和克唑替尼联合治疗(即使用EGFR TKI出现MET扩增耐药后双药联合治疗）出现耐药的原因之一。有个案报道，针对患者服用克唑替尼联合奥西替尼耐药可能出现了MET（D1228N）突变的情况，予以II型MET抑制剂卡博替尼联合奥西替尼患者再次出现疾病控制。
2、MET EX14突变的靶向治疗：区别于可以改变MET激酶构象的激酶结构域突变，理论上MET EX14突变型同样具有与MET野生型相似的激酶结构域。因此，I型和II型MET抑制剂都能抑制这种突变型，且在相应的肿瘤模型中显示出了良好活性。MET抑制剂最开始在MET EX14突变的NSCLC患者中表现出疗效的就是I型MET抑制剂-克唑替尼。
在“PROFILE 1001”的I期临床试验中研究人员招募了69名具有MET EX14突变的晚期NSCLC患者，进行克唑替尼疗效研究，总体中位PFS为7.3个月，在65名可评估患者中，ORR为32%。这一研究结果为克唑替尼纳入NCCN指南提供了有力证据。基于这些数据美国FDA于2018年授予克唑替尼突破性疗法资格，用于治疗接受含铂方案化疗后进展出现MET EX14突变的NSCLC患者。
自克唑替尼被FDA授予突破性疗法资格后，新的药物纷纷登场，包括括选择性Ib 型MET抑制剂卡马替尼、特泊替尼和沃利替尼，这些药物已经在MET EX14突变的NSCLC患者中进行了研究(表1)。这些选择性的MET抑制剂比克唑替尼能更有效地抑制MET活性。在一项名为“GEOMETRY”的研究中，卡马替尼单药初次治疗或者用于接受过化疗的非小细胞肺癌患者ORR分别可达68%和41%。基于此数据，卡马替尼获得了美国FDA批准用于MET EX14突变的（晚期）非小细胞肺癌患者的适应症，且并未限制药物治疗线数。
表1：针对MET14号外显子突变靶向药物一览表
而特泊替尼（另一种选择性MET抑制剂）在一项名为 “VISION”的研究中，85例合并MET EX14突变的晚期NSCLC患者接受特泊替尼单药治疗的ORR为可达44%。在一项II期临床试验中，沃利替尼治疗MET EX14突变的肺肉瘤样癌或其他NSCLC患者ORR可达到55%。但与克唑替尼相比，这些新药的疾病控制持续时间和毒副作用尚在长期观察之中。
MET抑制剂的获得性耐药机制，如MET扩增和MET激酶结构域突变，已经在耐药患者中得以确认。尽管HFG扩增在获得性耐药中已被检测出，但其扮演的角色尚需验证。虽然在一组MET扩增的人类癌细胞系和小鼠移植瘤实验中HFG降低了MET抑制剂的活性，但HFG扩增对于MET EX14突变的NSCLC患者到底有何影响尚无数据支持。
MET融合
一、临床分子病理学特征
最初在经化学致癌物转化的骨肉瘤细胞系中发现了TPR-MET（启动子区域）融合并确定了其致癌效应。随后在胃癌、甲状腺癌、肾乳头状癌、肺腺癌、肝细胞癌、神经胶质瘤和肉瘤患者中均有发现MET融合。MET融合的确切频率尚不清楚，尽管它们在神经胶质瘤中被检测出频率（约12%）较高。除了TPR-MET外，还有其他多种MET融合方式被发现(图4)。这些融合可以是染色体内融合(如PTPRZ1 MET、CLIP2 MET、CAPZA2 MET和ST7 MET)也可以是染色体间融合(如KIF5B MET)，两种类型约各占一半。在胶质母细胞瘤患儿中，染色体内融合似乎更常见，最常涉见的融合为PTPRZ1。MET融合可发生在同臂(不包括着丝粒)或臂间(包括着丝粒)，后者似乎更常见。
图4：MET融合示意图
MET融合通常涉及基因组内的MET15号外显子，该外显子负责编码MET激酶结构域，以及一些MET上游基因的二聚体结构域，从而导致不依赖配体的MET受体激活。此外，一些融合(如TPR-MET)被发现未涉及14号外显子，从而使MET的激活机制类似于MET EX14跳跃突变。有趣的是，不含14号外显子的融合反而比包含14号外显子的融合(如KIF5B MET和PTPRZ MET)似乎更容易驱动肿瘤发生。在PTPRZ MET融合中，PTPRZ启动子通常和MET基因全长区域融合，包括2号外显子上的MET二聚体结构域，这种融合导致了MET的过表达和下游信号的异常激活。
二、MET融合的检测
三、靶向治疗
MET过表达
MET过表达在肿瘤发生中扮演了不同的角色。首先MET可在肿瘤细胞缺氧和/或炎症环境下被诱导转录，激活增殖、减少凋亡和促进细胞迁移。因此，即使在没有MET扩增、突变或融合等基因改变驱动的情况下，肿瘤也可能依赖于MET信号而发生。理论上也可以对其使用MET抑制剂，但目前对其使用MET单抗治疗以失败告终，对MET过表达的患者使用MET TKI也几乎没有表现出疗效。令人期待的是一些双特异性抗体（作用于同一个受体的两个不同的表位）和抗体-药物偶联剂（Antibody-drug conjugates，以下简称ADCs药物）正在进行试验阶段。此外，MET过表达可以和MET基因其他改变同时存在。
一、过表达的检测
1、免疫组织化学法（IHC）：许多抗MET抗体已被用于MET过表达的免疫组化(IHC)检测。这些抗体包括单克隆抗体(如SP44、cMET和MET4)、多克隆抗体(如多克隆MET AF276)和磷酸化MET抗体(如pMET Y1349)。其中较常用的是兔抗总MET单克隆抗体SP44。这些抗体目前孰优孰劣尚无明确结论。评估MET的表达有不同的评分系统。MET的表达水平通常被量化为0到3分的染色评分，依次对应表达水平为阴性(0)、弱阳性(1+)、中阳性(2+)或强阳性(3+)。染色分数为1+表示有MET表达，评分为2+ (MET过表达)即至少50%细胞的呈现染色阳性，这一分数是临床试验中MET阳性的常用界定值。另一种评分系统是H-score系统，其评估方法是将染色得分≥1分的细胞百分比乘以染色强度得出一个分值。H分值范围为0-300分，200分以上分值被认为MET过表达，但在不同的研究中设定有不同的界定值，一些研究者将中位H分数作为划分过表达的标准（包括一些特殊样本的H分数同样纳入计算）。因为缺乏统一，这就使得使用这种方法开展的研究难以标化和普及。
2、质谱分析：基于质谱的选择性反应(SRM-MS)首先对肿瘤细胞的蛋白进行连续电离和裂解，然后计算每个样本MET蛋白的分子量(每微克的摩尔量)。SRM-MS可以对福尔马林固定石蜡包埋的组织切片中MET进行定量分析，包括固定1年以上的标本。研究报告显示质谱法可重复性也很强。与免疫组化相比，SRM-MS不太容易受到观察者间偏倚的影响，可以检测到较低水平的蛋白表达。然而，SRM- MS不能区分表达的蛋白来自于肿瘤细胞还是普通细胞，因此，MET定量检测结果可能受到混合间质和/或炎症浸润细胞的影响。此外，SRM-MS比IHC技术要求更高，也更昂贵，导致其很难被广泛使用。免疫组化目前在病理学诊断中还是最常规使用的方法，而SRM-MS在很大程度上目前处于研究阶段。
二、MET过表达和其他MET基因变异的相关性
MET过表达检测已在研究作为筛选MET驱动改变的一种手段。遗憾的是，MET过表达并不是MET扩增或MET EX14突变的可靠指标，目前对于MET融合检测的数据也比较有限。不同于ALK的检测，ALK使用IHC检测到的过表达水平与FISH检测到的ALK基因重排存在密切关联，而MET融合却不具备这一相关性。
1、过表达和MET扩增的相关性：如前所述，IHC检测的MET过表达与MET扩增无明确相关性。这种相关性的缺失可能因为样本中MET扩增水平较低，大量无蛋白表达，也有可能是受到了转录后和/或翻译后调控。在肺癌突变联盟(LCMC)的一系列研究中，74名MET过表达（H评分≥200分）患者中仅仅只有1例（1%）检测出MET扩增(MET/CEP7＞2.2)，以上研究使用FISH法进行MET扩增检测，NGS法数据有限。
2、过表达和MET突变的相关性：尽管理论上大家认为NSCLC细胞中MET EX14突变总会伴随MET蛋白的过表达，但是在这些MET EX14突变的患者中不论使用IHC或者质谱检测总有部分结果为MET表达阴性。在一项纳入25例MET EX14突变NSCLC患者的研究中，只有16例(64%)呈现MET过表达（IHC 染色评分2+），使用质谱检测也发现三分之一左右患者MET表达呈现阴性。与MET扩增的肿瘤类似，MET EX14突变患者的MET表达可能也受到转录后或翻译后水平的调控因此导致基因表达和蛋白表达水平分离。在之前讨论的肺癌突变联盟系列研究中，74例MET过表达(H评分≥ 200)患者中仅仅只有2例(3%)中检测到MET EX14突变。其他研究表明，使用MET过表达结果（IHC法检测）作为MET EX14突变的预测指标敏感性和特异性并不稳定，有研究在NSCLC患者组群中发现这种预测14%的敏感性和特异性分别为14%和47%，而在肺肉瘤样肺癌中敏感度为20%，特异性为83%。对于其他MET突变(如激酶结构域突变)，MET过表达作为预测指标的相关研究也尚未大规模开展。
三、靶向治疗
对此，有研究对新的抗MET抗体治疗策略进行了探索，包括能针对MET不同表位的抗体(如Sym015)，这些抗体对MET过表达和MET EX14突变的细胞系表现出实验室活性。以MET为靶点的抗体偶联药物（ADCs）也在研究中。这些药物的优势在于他们能借助MET瞄准肿瘤细胞，无关肿瘤细胞对MET通路依赖程度，即使在较低的MET表达水平也能实现有效的药物载荷传递。例如，在一项针对ADC类药物telisotuzumab vedotin（Teliso-V）作用机制的研究中，发现MET表达水平与各种实体肿瘤治疗效果无明显相关性，但值得注意的是MET也可以在正常肺组织中表达，因此，肺毒性可能是这类治疗的潜在问题。
讨 论
*重点小结及相关扩展
1、常见MET TKI分类
2、MET基因变异类型汇总
3、不论是NGS还是FISH法检测，不论是使用GCN还是MET /CEP7界定的MET扩增，扩增水平越高，临床获益可能性越大。
4、对于MET EX14突变的患者，MET TKI客观反应率和突变的位置(剪切受体或配体位点)或突变类型(碱基插入/缺失或碱基置管)或者是否合并了MET扩增无明确相关性
5、目前主流观点认为MET蛋白过表达并非MET基因变异的平行预测指标，也不是MET TKI疗效的预测指标。
参考文献
Robin Guo et al, MET-dependent solid tumours—molecular diagnosis and targeted therapy; [J ]Nature Reviews Clinical Oncology, Aug 2020
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